بررسی افزایش آلکالوئیدهای دارویی مورفینان در گیاه خشخاش ایرانی (papaver bracteatum) با استفاده از بیان موقت ژن و ریشه مویی تراریخت

چکیده خشخاش ایرانی با نام علمی papaver bracteatum از گونه های بومی ایران، دارای بیش از 100 آلکالوئید بنزیل ایزوکوئینولین مختلف است که برخی از آنها نظیر مرفین و کدئین به عنوان ضد درد، پاپاورین به عنوان شل کننده عضلات، نوسکاپین به عنوان داروی ضد تومور، سانگواینارین به عنوان ترکیب ضد میکروبی و تبائین که به عنوان ماده خام برای تولید داروهایی چون اکسی کدون، نالتروکسان و نالوکسان به کار می رود، از نظر پزشکی دارای اهمیت می باشند. از آنجا که این گیاه محتوی تبائین بالا و مورفین پائینی دارد، می تواند در جهت تولید بالاتر مورفین مورد دستکاری قرار گیرد. در این تحقیق سعی شده است تا یک روش موثر برای القای ریشه مویی تراریخت از این گیاه که دارای ژنهای نوترکیب در مسیر ساخت آلکالوئیدهای مورفینان ارائه شود. در ابتدا سازه های ژنی pbi121codr و pbi121sat حاوی دو ژن کدئینون ردوکتاز و سالوتاریدینول استیل ترانسفراز که از آنزیم های مهم در مسیر بیوسنتز تبائین و مورفین و کدئین می باشند به agrobacterium tumefaciens نژاد gv3101 منتقل و برای بیان موفت ژن به روش اگرواینفیلتریشن آماده گردید. بیان موقت این ژن ها، کارایی موثر سازه های یاد شده را در تنظیم مولکولی مسیر بیوسنتز آلکالوئیدهای مورفینان ثابت کرد. در مرحله بعد اثر نژادهای مختلف باکتری a. rhizogenes، lba9402, atcc15843, a13, a4, msu440 و نیز ریزنمونه های مختلف گیاهی در میزان فراوانی القای ریشه مویی بررسی گردید. از طرفی اثر ترکیبات عناصر ماکرو در محیط هم کشتی بررسی و بهینه سازی شد و بهترین محیط هم کشتی با کاهش نمک های ms معرفی گردید. همچنین برای معرفی بهترین محیط کشت مایع جهت رشد ریشه ها ی مویی از تغییرات در منبع کربن محیط و نسبت یون های nh4/no3 استفاده شد و بالاترین میزان تولید بیوماس در محیط حاوی نسبت 10:20 بدست آمد. استفاده از یک میلی گرم در لیتر آرژنین در محیط هم کشتی نیز سبب افزایش در فراوانی تراریختی گردید. سازه های ژنی pbi121codr و pbi121sat به نژادی از باکتری a. rhizogenes که بالاترین فراوانی القای ریشه مویی را داشت منتقل گردید. تراریختی با ریز نمونه های انتخاب شده (ساقه بریده شده) صورت گرفت و برای تایید ورود ژن ها در لاین های تراریخت ریشه مویی از pcr با آغازگرهای پیش رو camv 35s و معکوس ژن های مورد نظر و نیز آزمون دورگه سازی سادرن با کاوشگر اختصاصی استفاده شد. به منظور بررسی بیان ژن ها استخراج rna صورت گرفت و cdna تهیه گردید. با استفاده از multiplex rt-pcr نیمه کمی با آغازگرهای اختصاصی ژن ها و آغازگرهای ژن اکتین به عنوان کنترل داخلی نتایج ژل های الکتروفورز بدست آمده با نرم افزار total lab بررسی و افزایش بیان ژن ها تایید گردید. همچنین لاین های مختلف ریشه مویی ونمونه شاهد خشک و عصاره گیری با روش ریفلاکس با حلال صورت گرفت. در ادامه آزمون hplc با استفاده از استانداردهای مورفین و کدئین و تبائین برای بررسی میزان آلکالوئیدهای مورفینان انجام گردید و افزایش ترکیبات مورد نظر اثبات شد. نتایج حاصل از آنالیز داده های الکتروفورزی با استفاده از نرم افزار totallab کمی سنجی شد که نشان داد لاین های تراریخت شده با ژن codr نوترکیب 7 تا 10 برابر بیشتر از ریشه های مویی شاهد (فاقد ژن نوترکیب codr) دارای رونوشت مورد نظر می باشند. میزان مورفین و کدئین موجود در ریشه مویی های تراریخت شده با ژن codr ، به ترتیب 160 و 86 درصد نسبت به شاهد افزیش نشان می دهند. در مورد ریشه مویی های تراریخت شده با ژن salat میزان 107 تا 130 درصد افزایش در رونوشت ژن salat نسبت به ریشه طبیعی وجود داشت. لاین ریشه مویی تراریخت hrsalat1 ، 30 درصد تبائین بالاتری نسبت به ریشه مویی بدون ژن نوترکیب salat از خود نشان دادند.